Strona główna Szpital Badania i Projekty Projekty PROJEKTY W TRAKCIE REALIZACJI Programy Krajowe Kompleksowa ocena właściwości skrzepów fibrynowych u chorych ze stenozą aortalną – wpływ oksydacji fibrynogenu na rozwój choroby - OKSYDACJA

Kompleksowa ocena właściwości skrzepów fibrynowych u chorych ze stenozą aortalną – wpływ oksydacji fibrynogenu na rozwój choroby - OKSYDACJA

Projekt jest finansowany ze środków na naukę z budżetu Narodowego Centrum Nauki

Projekt: PRELUDIUM

Kwota projektu ogółem: 149 940,00 PLN, w tym:

kwota dofinansowania: 149 940,00 PLN

wkład własny: 0,00 PLN

Realizacja projektu: 27.02.2017 – 26.02.2020

Krótki opis projektu:                                                                                  

Stenoza aortalna (AS) jest najczęstszą chorobą zastawkową serca, której częstość występowania wzrasta wraz z wiekiem. Wiele badań sugeruje aktywną rolę białek krzepnięcia krwi w regulacji i progresji AS. W tkankach zastawek stenotycznych wykazano obecność czynnika tkankowego (TF), którego ekspresja pokrywała się z obszarami występowania fibryny co sugeruje, że przekształcenie fibrynogenu w fibrynę zachodzi in loco w płatkach zastawek stenotycznych. Natorska i wsp. wykazali pozytywną korelację pomiędzy ilością fibryny w płatkach zastawek aortalnych a wydłużonym czasem lizy skrzepu fibrynowego, wskazując na zaburzoną fibrynolizę u chorych z izolowaną AS. Ponadto, zaobserwowano że ekspresja TF pokrywa się z obszarami nacieku makrofagów, dowodząc prozapalnej roli TF w płatkach zastawek. Wydaje się zatem, że czynniki mające bezpośredni wpływ na białka krzepnięcia oraz fibrynolizę, takie jak stres oksydacyjny, mogą być odpowiedzialne za aktywację szlaków sygnalizacyjnych prowadzących do uszkodzenia zastawki aortalnej. Poziom stresu oksydacyjnego jest znacznie podwyższony w płatkach zastawek w wyniku miejscowych procesów zapalnych i może być powiązany z oksydacją fibrynogenu /fibryny in loco. Ponieważ wiadomo, że reaktywne formy tlenu (ROS) mogą zmieniać strukturę fibrynogenu zarówno w zawale mięśnia sercowego jak i u chorych ze stabilną chorobą wieńcową, prawdopodobnym jest, że podobne procesy zachodzą w płatkach zastawek stenotycznych, nasilają miejscowe zapalenie i prowadzą do włóknienia płatków. W świetle powyższych informacji przypuszczamy, że pacjenci z prozakrzepowym fenotypem skrzepów fibrynowych są bardziej narażeni na rozwój ostrych form AS. Ponadto, wzmożona oksydacja fibrynogenu/fibryny może przyczyniać się do powstawania większych złogów fibryny w płatkach zastawki aortalnej, prowadząc do jej zwłókniania i wzrostu sztywności. Będzie to pierwsze badanie określające czy prozakrzepowy fenotyp skrzepu fibrynowego oraz oksydacja fibrynogenu wpływają na zaawansowanie choroby. Cel naukowy zostanie osiągnięty poprzez weryfikację dwóch oryginalnych hipotez badawczych: 1. Pacjenci tworzący zbite skrzepy, charakteryzujące się mocno rozgałęzionymi włóknami fibryny i wydłużonym czasem lizy skrzepu fibrynowego są bardziej podatni na rozwój lokalnego zapalenia i rozwój AS. 2. Oksydacja fibrynogenu prowadzi do wzmożonego odkładania się fibryny w płatkach zastawek stenotycznych i nasilenia stanu zapalnego charakterystycznego dla zaawansowanej AS.

Metodyka badań

Do badania zostanie włączonych 150 kolejnych chorych w wieku 18-75 lat z rozpoznaną izolowaną AS, w tym co najmniej 50 pacjentów zakwalifikowanych do operacji wymiany zastawki. Zastosowano następujące kryteria wykluczające pacjentów: reumatyczna AS, ostra infekcja, zdiagnozowany nowotwór, przebyty zawał serca lub udar mózgu, ciąża, udokumentowana zaawansowana miażdżyca oraz cukrzyca. Przy pomocy rutynowych technik laboratoryjnych u pacjentów oceniane będą: morfologia, lipidogram, poziom glukozy, kreatyniny, fibrynogen oraz reaktywnego białka C (CRP). Poziom D-dimerów w osoczu zostanie oznaczony z użyciem systemu VIDAS D-dimer. Następujące metody badawcze będą wykorzystane podczas realizacji projektu: turbidymetryczna ocena formowania skrzepu (maksymalne nachylenie, opisujące szybkość łączenia się protofibryli; faza lag, czas przed rozpoczęciem bocznej agregacji protofibryli; maksymalna absorbancja, odzwierciedlająca strukturę skrzepu), ocena przepuszczalności skrzepu pod ciśnieniem hydrostatycznym (opisująca porowatość skrzepu przy zastosowaniu opatentowany układ półautomatycznego zaprojektowanego w Krakowskim Szpitalu im. Jana Pawła II), analiza podatności skrzepu na lizę (przy użyciu 3 różnych testów o różnym stężeniu końcowym rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu, z/bez egzogenną trombiną), analizy reometryczne oceniające lepkosprężystość skrzepu fibrynowego (maksymalny moduł sprężystości (EM), który odzwierciedla sztywność skrzepu i czas krzepnięcia, definiowana jako czas potrzebny do osiągnięcia maksymalnego EM) i skaningowa mikroskopia elektronowa, do oceny struktury sieci fibrynowej (grubości włókien fibryny i ilości rozgałęzień). Karbonylacja białek osocza i wyizolowanego fibrynogenu będzie oceniona w oparciu o zawartość reszt karbonylowych, poprzez zastosowanie 2-4 dinitrofenylohydrazyny, jak opisano poprzednio. Stopień utlenienia białek osocza zostanie określony na podstawie stężenia malonodialdehydu, poprzez pomiar substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym. Fluorescencja i chemiluminescencja będą stosowane do oceny ilości nadtlenków, nadtlenek wodoru i oksydazy NADPH. Immunofluorescencja pozwoli ocenić lokalizację in loco fibryny, makrofagów i TF obrębie zastawek pacjentów z ciężką AS. Niektóre z doświadczeń zostaną wykonane we współpracy z prof. Ariens’em (University of Leeds, Wielka Brytania) i prof. Wallén’em (Szpital Danderyd, Sztokholm, Szwecja).
Uzasadnienie nowatorskiego charakteru badań. W wielu badaniach opisywano mechanizmy rozwoju i progresji AS ale tylko nieliczne z nich dotyczą roli oksydacji białek zastawek aortalnych. Według naszej wiedzy, w dostępnej literaturze nie ma żadnych doniesień opisujących wpływ oksydacji na białka krzepnięcia w AS. Projekt ten pozwoli zweryfikować, czy pacjenci z prozakrzepowym fenotypem skrzepu fibrynowego są bardziej narażeni na rozwój ostrych form AS i czy oksydacja fibrynogenu powoduje zwiększone odkładanie się fibryny w obrębie płatków zastawki, prowadząc do ich nadmiernego włóknienia i wzrostu sztywność. Może to przyczynić się do odkrycia nowych celów terapeutycznych w leczeniu AS.

Kierownik Projektu: mgr inż. Jakub Siudut

 

Szpital